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多聚(A)聚合酶詳細(xì)說(shuō)明

更新時(shí)間:2023-07-30      點(diǎn)擊次數(shù):1374

多聚(A)聚合酶

用于制作 PolyA 加尾 RNA 和 3' 末端 RNA 標(biāo)記



1000 U 的 Poly(A) 聚合酶 (5000 U/mL) 和 10x Poly(A) 聚合酶反應(yīng)緩沖液。

Poly(A) 聚合酶適用于分子生物學(xué)應(yīng)用。該產(chǎn)品既不用于疾病的診斷、預(yù)防或治療,也未經(jīng)過(guò)驗(yàn)證可單獨(dú)使用或與其他產(chǎn)品結(jié)合使用。

特征

  • 催化 ATP 中的 AMP 添加到 RNA 的 3' 羥基上


產(chǎn)品詳情

Poly(A) 聚合酶將 ATP(由 AMP 催化)附著到 RNA 的 3? 羥基上,這對(duì)于制備帶有 Poly(A) 尾的 RNA 非常有用。

該酶以 25 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、1 mM MgCl 2、0.1 mM DTT、0.1 mM EDTA 和 50% 甘油的形式提供;25°C 時(shí) pH 8.0。

10 倍濃度的 Poly(A) 聚合酶反應(yīng)緩沖液包含 500 mM Tris-HCl、2.5 M NaCl 和 100 mM MgCl 2,25°C 時(shí) pH 為 7.9。


表現(xiàn)

Poly(A) 聚合酶催化 ATP 中的 AMP 添加到 RNA 的 3? 羥基上。該反應(yīng)需要 Mg 2+并且與模板無(wú)關(guān)。

  • 存儲(chǔ)溫度:–25°C 至 –15°C

  • 分子量:53,870 道爾頓

測(cè)試測(cè)試單位規(guī)格
純度
>95%
具體活性
>20,000 U/毫克
單鏈核酸外切酶200U<5% 釋放
雙鏈核酸外切酶200U釋放<1%
雙鏈核酸內(nèi)切酶200U無(wú)轉(zhuǎn)換
大腸桿菌DNA 污染100U<10份
核糖核酸酶污染200U未檢測(cè)到非特異性 RNase


原則

?該蛋白質(zhì)由表達(dá)質(zhì)粒 Poly(A) 聚合酶基因的 大腸桿菌菌株產(chǎn)生。

1 個(gè)單位定義為在 37°C 下 10 分鐘內(nèi)將 1 nmol ATP 結(jié)合到酸不溶性物質(zhì)中的酶量。

程序

使用說(shuō)明

1. 按所列順序配制總體積為 20 µL 的以下反應(yīng)混合物:

  • 15 µL 無(wú)核酸酶水中的 1-10 µg 純化 RNA

  • 2 µL 10x Poly(A) 聚合酶反應(yīng)緩沖液 (B7460)

  • 2 µL 10mM ATP (N2070-10)

  • 1 µL Poly(A) 聚合酶 (P7460L)

2. 將反應(yīng)混合物在 37°C 下孵育 30 分鐘。

3. 通過(guò)添加 EDTA(終濃度 10mM)終止反應(yīng)或繼續(xù)進(jìn)行凈化步驟。?

質(zhì)量控制

使用兩倍系列稀釋法測(cè)量比活性。在 1x 反應(yīng)緩沖液(50 mM Tris-HCl、250 mM NaCl、10 mM MgCl 2、pH 7.9、25°C 下)中稀釋酶,并添加到含有 15-mer RNA 寡核苷酸、1x 反應(yīng)緩沖液的 50 µL 反應(yīng)液、1 mM ATP、2.5 mM MnCl 2和 3H-ATP。反應(yīng)在 37°C 下孵育 10 分鐘,置于冰上,并使用 Sambrook 和 Russell 的方法進(jìn)行分析(分子克隆,v3,2001,第 A8 頁(yè))。 25-A8.26)。

蛋白質(zhì)濃度由 OD 280吸光度確定。

通過(guò)濃縮和稀釋酶溶液的 SDS-PAGE,然后進(jìn)行銀染檢測(cè)來(lái)評(píng)估物理純度。通過(guò)將濃縮樣品中污染物條帶的總質(zhì)量與稀釋樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的條帶質(zhì)量進(jìn)行比較來(lái)評(píng)估純度。

單鏈核酸外切酶在 50 µL 反應(yīng)液中測(cè)定,其中含有放射性標(biāo)記的單鏈 DNA 底物和 10 µL 酶溶液,并在 37°C 下孵育 4 小時(shí)。

雙鏈核酸外切酶活性在 50 µL 反應(yīng)液中測(cè)定,其中含有放射性標(biāo)記的雙鏈 DNA 底物和 10 µL 酶溶液,并在 37°C 下孵育 4 小時(shí)。

雙鏈核酸內(nèi)切酶活性在含有 0.5 µg 質(zhì)粒 DNA 和 10 µL 酶溶液的 50 µL 反應(yīng)液中測(cè)定,并在 37°C 下孵育 4 小時(shí)。

使用 5 µL 酶溶液重復(fù)樣品評(píng)估大腸桿菌污染,這些樣品已變性,并使用與 16S rRNA 基因座相對(duì)應(yīng)的寡核苷酸引物 ?在 TaqMan qPCR 測(cè)定中篩選污染大腸桿菌基因組 DNA 的存在?。?

使用 RNAse Alert 試劑盒(Integrated DNA Technologies)按照制造商的指南評(píng)估非特異性 RNAse 污染。


應(yīng)用領(lǐng)域

該產(chǎn)品可用于分子生物學(xué)應(yīng)用,例如:

  • 制備多聚A尾RNA

  • 3'端RNA標(biāo)記

  • mRNA療法



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