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如何為 ELISA 試劑盒制備細(xì)胞或組織裂解物。

更新時間:2023-08-03      點擊次數(shù):896

為 ELISA 試劑盒制備細(xì)胞或組織裂解物

與 RayBio ® ELISA 試劑盒一起使用的細(xì)胞或組織裂解液可以使用大多數(shù)常規(guī)方法來制備,例如在RayBio® 裂解緩沖液中勻漿細(xì)胞或組織。您還可以使用自己的裂解緩沖液,例如 RIPA 或其他針對免疫沉淀優(yōu)化的配方。

請注意以下有關(guān)裂解緩沖液成分的指南:

  1. 避免使用 >0.1% SDS 或其他強變性洗滌劑。一般來說,非離子型去污劑(如 Triton X-100 或 NP-40)是好的,但兩性離子型去污劑(如 CHAPS)或溫和的離子型去污劑(如脫氧膽酸鈉)也可以。

  2. 總洗滌劑用量不超過 2% v/v

  3. 避免使用疊氮hua鈉

  4. 避免使用 >10 mM 還原劑,例如二硫蘇糖醇或巰基乙醇

我們強烈建議在均質(zhì)化之前向裂解緩沖液中添加蛋白酶抑制劑混合物。大多數(shù)通用生化供應(yīng)公司(包括 Roche、Sigma-Aldrich、Pierce 和 Calbiochem)都備有多種此類產(chǎn)品。由于對蛋白水解的敏感性和裂解液中存在的蛋白酶類型各不相同,因此我們不推薦特定的產(chǎn)品。相反,您選擇使用哪種蛋白酶抑制劑組合應(yīng)基于對您感興趣的蛋白質(zhì)和/或組織或細(xì)胞類型的文獻(xiàn)檢索??梢允褂昧姿崦敢种苿皇潜匦璧?,除非試劑盒中使用的抗體特異性識別蛋白質(zhì)的磷酸化形式。

裂解和勻漿方法的選擇包括玻璃珠“粉碎"、粉碎、凍融、超聲處理和用研缽和杵粉碎冷凍組織,甚至這些方法的組合。沒有適用于所有樣本類型的最佳方法;您應(yīng)該在簡要搜索文獻(xiàn)后選擇方法,以了解在以前的調(diào)查中如何準(zhǔn)備與您相似的樣本。

均質(zhì)化后,離心裂解物以去除細(xì)胞/組織碎片(5 分鐘 @ 10,000 xg 或 10 分鐘 @ 5,000 xg)并保存上清液。除非新鮮測試,否則裂解物應(yīng)盡快冷凍并儲存在 -20°C(或 -80°C,如果可能)下。在進(jìn)行任何免疫測定孵育之前再次離心。接下來,使用不受去垢劑抑制的總蛋白測定(例如二辛可寧酸 (BCA) 測定)確定裂解物的蛋白質(zhì)濃度,并標(biāo)準(zhǔn)化每個樣品的體積,以便為每個測定提供相同量的總蛋白。

注意:不建議使用 Bradford 測定法,因為它可能會因洗滌劑的存在而受到抑制。

由于不同的細(xì)胞和組織可能含有不同量的蛋白質(zhì),作為起點,我們建議每 1x10 6 個細(xì)胞或 10 mg 組織使用 500 µL 裂解緩沖液。您可能需要根據(jù)您的結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。勻漿的目標(biāo)總蛋白濃度應(yīng)至少為 1,000 µg/mL,但 2,000 µg/mL 或更高會更好。

無論您擁有哪種樣品類型,強烈建議您在制備后對所有樣品進(jìn)行分裝,以大程度地減少多次凍融循環(huán)造成的蛋白質(zhì)降解。這也確保了進(jìn)一步實驗的樣品的可用性。




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