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如何選擇染料

更新時(shí)間:2023-10-17      點(diǎn)擊次數(shù):862

為了使用熒光標(biāo)記物獲得最佳結(jié)果,必須考慮幾個(gè)因素。

首先,這是激發(fā)光源:為了減少樣品自發(fā)熒光可能產(chǎn)生的干擾,激發(fā)波長(zhǎng)優(yōu)選在550 nm甚至600 nm以上。除了減少背景之外,紅色光譜范圍在處理活細(xì)胞時(shí)也具有優(yōu)勢(shì),因?yàn)榭梢詼p少損傷。

其次,熒光標(biāo)記應(yīng)在激發(fā)波長(zhǎng)下具有強(qiáng)吸收以及高熒光量子產(chǎn)率。消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率的乘積通常稱(chēng)為染料的“亮度"。

染料的熒光效率在光譜的藍(lán)色和綠色區(qū)域最高。在某些情況下,量子產(chǎn)率幾乎達(dá)到100%的理論極限。對(duì)于更長(zhǎng)的波長(zhǎng),發(fā)射的量子產(chǎn)率急劇下降,尤其是在水溶液中。然而, ATTO-TEC已成功開(kāi)發(fā)出即使在 650 nm 下也具有高量子產(chǎn)率的熒光標(biāo)記。例如,ATTO 647N在水溶液中發(fā)出的熒光強(qiáng)度是舊花青染料 Cy5 的兩倍。ATTO 647N和 Cy5 的相對(duì)熒光強(qiáng)度。PBS 水溶液1 cm 池中相應(yīng)吸收最大值處的吸光度為 0.04。22 °C 時(shí)兩個(gè)吸收光譜(相同吸收)交叉處的熒光激發(fā)。

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最后,標(biāo)記物的發(fā)射光譜應(yīng)與所用濾光片組的傳輸相匹配。反過(guò)來(lái),必須選擇濾光片組,使其阻擋樣品散射的激發(fā)光并允許熒光盡可能有效地通過(guò)。

當(dāng)使用波長(zhǎng)為 635 nm 的二極管激光器作為激發(fā)源以及在 650 nm 至 750 nm 之間具有高透射率的濾光片組時(shí),例如ATTO 647N將是一個(gè)非常好的選擇。從ATTO染料列表可以看出, ATTO647N635 nm處具有高消光系數(shù),接近吸收曲線最大值的波長(zhǎng),以及優(yōu)異的熒光量子產(chǎn)率(η fl = 65%)。

下表概述了一些常用的激勵(lì)源和推薦的ATTO標(biāo)簽。
 

光源發(fā)射線適用染料
水銀蒸氣燈365納米
405納米
436
納米 546納米
577納米
ATTO 390
ATTO 425、ATTO 430LS
ATTO 425、ATTO 430LS、ATTO 465
ATTO 550、ATTO 565
ATTO Rho12、ATTO Rho101、ATTO 590
ATTO Rho13、ATTO 594、ATTO 610、ATTO Rho14
氬離子激光器488nm

514nm
 
ATTO 488、ATTO 490LS
ATTO 514、ATTO 520
ATTO 514、ATTO 490LS、ATTO 520
ATTO 532、ATTO 542
Nd:YAG 激光器,
倍頻
532納米ATTO 532、ATTO Rho6G、ATTO 542
ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho11、ATTO Rho12
氦氖激光器633納米ATTO 643、ATTO 633、ATTO 647、
ATTO 647 N、ATTO 655
氪離子激光器647nm

676nm
ATTO 643 ATTO 647、ATTO 647 N、ATTO 655、
ATTO Oxa12、ATTO 665、ATTO 680
ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740
二極管激光器635納米ATTO 633、ATTO 643、ATTO 647、
ATTO 647 N、ATTO 655


熒光標(biāo)記物的特性
然而,應(yīng)該注意的是,除了已經(jīng)討論的光學(xué)考慮因素之外,選擇標(biāo)記時(shí)其他因素也很重要,例如染料的 pH 依賴(lài)性光學(xué)和化學(xué)特性、其溶解度、光和化學(xué)特性穩(wěn)定性、發(fā)色團(tuán)的大小或連接體的長(zhǎng)度等,其涉及或滿(mǎn)足各自應(yīng)用的要求。這些特性與染料作為熒光標(biāo)記物的適用性非常相關(guān)。

最重要的是,染料在照射過(guò)程中保持完整。許多常見(jiàn)的標(biāo)記,例如熒光素衍生物 FITC,具有非常低的光穩(wěn)定性。因此,當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間觀察過(guò)程時(shí),使用高強(qiáng)度激光激發(fā)時(shí)成像的靈敏度和質(zhì)量會(huì)受到限制。這對(duì)于顯微鏡和其他基于共焦原理的技術(shù)(例如單細(xì)胞的檢測(cè))來(lái)說(shuō)是一個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)。與一些常用的舊染料相比,新型ATTO標(biāo)簽的設(shè)計(jì)即使在長(zhǎng)時(shí)間暴露后也顯著更加穩(wěn)定。

ATTO 655與傳統(tǒng) Cy5的光穩(wěn)定性比較TM在水里。使用 250 W 鹵鎢燈照射,聚焦到 1 cm 池中。消光與照射持續(xù)時(shí)間。

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許多常見(jiàn)的熒光標(biāo)記物即使在沒(méi)有照射的情況下(即在黑暗中)也會(huì)分解,特別是當(dāng)暴露于實(shí)驗(yàn)室大氣中的低濃度臭氧時(shí)。在相同的臭氧暴露條件下,染料ATTO 647NATTO 655的穩(wěn)定性比花青染料 Cy5 TM和 Alexa647 TM長(zhǎng) 100 倍。這在微陣列應(yīng)用中非常重要,因?yàn)槿玖戏肿游挥诒砻?,因此直接暴露在大氣中?/span>

緊湊而強(qiáng)大的激光二極管現(xiàn)在覆蓋了光譜的整個(gè)可見(jiàn)光和近紅外部分。它們已作為非常有效的激發(fā)源進(jìn)入許多應(yīng)用/設(shè)備,并越來(lái)越多地取代傳統(tǒng)光源。

如果沒(méi)有最大吸收與現(xiàn)有激發(fā)源的波長(zhǎng)完*對(duì)應(yīng)的標(biāo)記,則應(yīng)選擇波長(zhǎng)稍長(zhǎng)的染料。吸收會(huì)稍微降低,但激發(fā)波長(zhǎng)和熒光光譜之間的較大差異(與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān))具有在檢測(cè)過(guò)程中更好地分離散射激發(fā)光的優(yōu)點(diǎn)。

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