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抗體驗證的*策略:封閉肽驗證

更新時間:2024-01-31      點擊次數(shù):745

據(jù)報道,每年因劣質(zhì)抗體造成的生物和醫(yī)學(xué)研究損失約為8億美元。此外,實驗結(jié)果不一致和抗體重復(fù)性差的后果 是無法估計的。

國際抗體驗證工作組(IWGAV)于2016年9月發(fā)表題為《 自然方法 中 抗體驗證的建議》的文章 ,強調(diào)抗體驗證應(yīng)根據(jù)目標(biāo)蛋白的相應(yīng)應(yīng)用和背景進行。作者提出了抗體驗證的五個概念支柱:(i)遺傳策略,(ii)正交策略,(iii)獨立抗體策略,(iv)標(biāo)記蛋白的表達,以及(v)免疫捕獲后進行質(zhì)譜分析。多發(fā)性硬化癥)。

 

這五種方法各有其優(yōu)缺點以及適用條件。例如,遺傳策略通過比較細(xì)胞或組織中的相關(guān)信號來評估抗體特異性,其中使用 CRISPR-Cas9 或 RNA 干擾 (RNAi) 敲除或敲低目標(biāo)基因與野生型 (WT) 對照的信號。盡管這種方法很簡單,但未能擊倒或敲除目標(biāo)基因?qū)⒋蟠髶p害該方法的實驗可行性。

 

免疫捕獲后進行質(zhì)譜 (MS) 的方法可以識別與純化抗體直接相互作用的蛋白質(zhì), 以及與目標(biāo)蛋白質(zhì)間接相互作用的其他蛋白質(zhì)。 然而,這種方法依賴于昂貴的科學(xué)儀器和實驗材料。并非每個實驗室都能負(fù)擔(dān)得起這些設(shè)備。

 

在 Affinity Biotech,抗體通過 獨立抗體驗證進行驗證。為此,使用幾種抗體來識別靶蛋白上的不同表位。具有最高特異性的抗體是通過包括比較和定量分析的適當(dāng)程序確定的。雖然大多數(shù)抗體的檢測應(yīng)該沒有問題,但對于檢測特異性要求較高的抗體,特別是那些位點特異性的磷酸化抗體,仍然不夠。

 

結(jié)合多年的抗體研發(fā)和生產(chǎn)經(jīng)驗,Affinity Biotech采用了更合適的抗體驗證策略: 封閉 肽驗證。

 

封閉肽(抗原)與抗體一一對應(yīng)。 。這是最原始的材料,只有原廠才能提供。

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首先,我們對封閉肽進行 MS 分析,以確保肽序列準(zhǔn)確。

在蛋白質(zhì)印跡分析中,肽會阻斷目標(biāo)抗體的信號。沒有封閉肽的泳道用作對照。封閉肽將與靶蛋白競爭結(jié)合位點,從而在封閉基團中不留下特異性條帶。

 

該策略目前用于驗證我們的抗體。它對于磷抗體的生產(chǎn)至關(guān)重要,因為它確保了磷抗體的位點特異性。換句話說,磷酸化抗體只能識別相應(yīng)位點的磷酸化靶蛋白。非磷酸化的目標(biāo)蛋白或其他位點磷酸化的目標(biāo)蛋白將不會被識別。

舉個例子。在 Phospho-MSK1 (Ser211) Antibody(貨號 AF7155)的蛋白質(zhì)印跡驗證中,泳道 1 和泳道 3 中分別添加了非磷酸化阻斷肽和磷酸化阻斷肽。 2號車道沒有被封閉。結(jié)果顯示,使用磷酸化肽封閉目標(biāo)蛋白后,沒有檢測到目的條帶。

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