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hellobio ICC 問題故障排除

更新時間:2024-02-26      點擊次數(shù):569

免疫細胞化學是一個漫長的多步驟過程,需要考慮許多不同的因素。在某些時候,不可避免地會出現(xiàn)問題或不是最佳狀態(tài)。以下匯總了一些可能導致免疫細胞化學不起作用的最常見陷阱。

問題 潛在原因 建議的解決方案
染色弱或缺失細胞已從蓋玻片上脫落

- 洗滌時更加輕柔或減少洗滌次數(shù)

細胞通透性較差 

- 嘗試增加 Triton X-100 的濃度

細胞干涸 - 確保在整個實驗過程中細胞始終被過量的液體覆蓋
細胞過度固定 

- 減少細胞與固定劑一起孵育的時間

一抗太少 

- 增加一抗?jié)舛?/span>
- 增加孵育時間
- 考慮采用三步檢測系統(tǒng)(例如基于生物素-鏈霉親和素)

光照 

- 確保應用二抗后樣品永遠不會暴露在光線下
- 成像時盡可能使用最小曝光量并小心漂白(尤其是使用共焦顯微鏡)

二抗錯誤 

- 確保二抗對一抗的培養(yǎng)物種具有特異性

靶細胞中不存在蛋白質(zhì)

- 檢查文獻以了解細胞群中是否預期存在蛋白質(zhì)
- 考慮使用陽性對照

表位因固定而被遮蓋 

- 嘗試不同的固定劑
- 嘗試添加抗原修復步驟

曝光時間太短 

- 增加成像時的曝光時間和/或增益

高背景非特異性結(jié)合

嘗試在沒有一抗的情況下測試二抗,以確保二抗不會與細胞內(nèi)的靶標結(jié)合

阻擋不良 

- 嘗試更換封閉液
- 嘗試增加封閉孵育時間

抗體濃度過高

- 嘗試降低一抗?jié)舛?/span>
- 嘗試降低二抗?jié)舛?/span>

反應性醛基 

- 考慮在 PBS 孵育步驟中引入 1% NaBH4

光譜重疊 

- 確保二抗的吸收/發(fā)射光譜不重疊

洗滌不足 

- 增加二次孵育后的洗滌步驟

非特異性染色抗體與其他蛋白質(zhì)中存在的表位結(jié)合 

- 嘗試不同的抗體,看看染色模式是否相關(guān)。

抗體濃度過高

- 嘗試降低一抗和二抗?jié)舛?/span>

與內(nèi)源性 IgG 的反應性 

- 嘗試使用在細胞來源以外的物種中產(chǎn)生的抗體(尤其是在原代細胞培養(yǎng)物中)



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