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hellobio免疫組織化學(xué) (IHC) 實(shí)驗(yàn)組織準(zhǔn)備

更新時(shí)間:2024-02-26      點(diǎn)擊次數(shù):587

高質(zhì)量的組織制備對(duì)于高質(zhì)量的免疫組織化學(xué)結(jié)果絕對(duì)必要,因此始終值得花時(shí)間確保按照盡可能高的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,以避免令人失望的結(jié)果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,組織可能需要新鮮使用或固定。

 

1 冷凍組織以供后續(xù)處理

有時(shí)需要在進(jìn)一步處理或隨后的固定之前冷凍組織。如果冷凍不當(dāng),可能會(huì)形成冰晶,損害細(xì)胞結(jié)構(gòu)。通過正確冷凍,這將保持組織的質(zhì)量,從而最大限度地提高免疫染色成功的機(jī)會(huì)。

1. 將裝有異戊烷的燒杯(長燒杯中至少 500ml)在 -80°C 中或使用干冰預(yù)冷至 -42°C 至 -45°C 之間。定期監(jiān)測(cè)溫度以確保溫度保持在這個(gè)范圍內(nèi)。

2. 在冰上使用干凈的工具解剖組織。

3. 將紙巾放在鋁箔上,并用濾紙除去多余的液體。

4. 將組織(不含鋁箔)輕輕浸入異戊烷中。冷凍所需時(shí)間取決于組織樣本大小,但冷凍成年大鼠大腦大約需要 5 分鐘。

5. 在從異戊烷中取出組織之前,預(yù)冷鑷子。將冷凍組織放入裝有軟紙巾的預(yù)冷管中。

6. 儲(chǔ)存于-80°C 直至下次使用。

2 灌注固定

一般來說,當(dāng)動(dòng)物被灌注固定時(shí),可以獲得最佳質(zhì)量的組織切片。該過程涉及先用緩沖液然后用固定劑替換血液,并且其具有高自發(fā)熒光。在嘗試之前,請(qǐng)確保您的監(jiān)管制度涵蓋了這一點(diǎn),并獲得經(jīng)驗(yàn)豐富的從業(yè)人員的培訓(xùn)。針對(duì)嚙齒類動(dòng)物的一般方案是:

1. 通過適當(dāng)途徑過量注射麻醉劑,直至動(dòng)物沒有腳趾捏和眨眼反射但心臟仍在跳動(dòng)。

2. 打開胸腔,露出心臟,剪斷右心房。將針插入左心室,并通過冰冷的 PBS(大鼠約 200ml,小鼠約 15ml)灌注,然后灌注類似體積的 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。

3. 取出大腦/其他器官,放入裝有 4% 多聚甲醛的小瓶中,在 4°C 下放置 24 小時(shí)。

4. 將組織移入 4°C 含 30% 蔗糖的 PBS 中,直至組織沉入小瓶底部

3 浸入固定

對(duì)于小體積的組織,通常用固定劑孵育組織就足夠了,而不是使用灌注固定。然而,這將導(dǎo)致較高的背景,因?yàn)檠翰粫?huì)從小毛細(xì)血管中去除。

1. 在冰上用干凈的工具解剖組織。

2. 用冰冷的 PBS 短暫清洗

3. 將組織放入含 4% 多聚甲醛的 PBS 中,4°C 下放置 24 小時(shí)

4. 將組織移入 4°C 含 30% 蔗糖的 PBS 中,直至組織沉入小瓶底部

4 切片

可以在一系列機(jī)器上切割切片,最常見的是低溫恒溫器和冷凍切片機(jī)。機(jī)器的選擇部分取決于可用性,部分取決于需要切割多厚的部分。檢查可用機(jī)器的規(guī)格是否與所需的截面厚度相匹配。

對(duì)于載玻片免疫組織化學(xué),切片可以直接切割到顯微鏡載玻片上,或者切割到 PBS 中,用于自由浮動(dòng)免疫組織化學(xué)。

切割后,切片可以冷凍以供日后處理:

  • 載玻片安裝:讓切片干燥后,切片可在 -20°C 至 -80°C 下保存長達(dá)一年

  • 自由浮動(dòng) 將切片轉(zhuǎn)移至冷凍保護(hù)劑中,然后在 -20°C 下保存長達(dá)一年。


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