diagnocine：DIG Labeled Blue Color Marker for Small RNA

DynaMarker DIG 標(biāo)記的小 RNA 藍(lán)色標(biāo)記物由彩色（藍(lán)色）和 DIG 標(biāo)記的 6 個(gè)單鏈核酸組成，其表觀分子量為 RNA 的 100、75、50、40、30 和 20 個(gè)堿基。該標(biāo)記物適用于監(jiān)測變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和抗 DIG 抗體的免疫檢測

圖 1. DynaMarker DIG 標(biāo)記的小 RNA 藍(lán)色標(biāo)記物 (5 μl) 在 15 % 聚丙烯酰胺 - 7.5 M 尿素凝膠/1 × TBE 緩沖液作為運(yùn)行緩沖液上的電泳圖譜。

DynaMarker DIG 標(biāo)記的小 RNA 藍(lán)色標(biāo)記物中條帶的表觀大小與未染色 RNA 的大小非常一致，長度為 100、75、50、40、30 和 20 個(gè)堿基（準(zhǔn)確度約為 95%，參見表 1） ）。用于小 RNA 的 DynaMarker DIG 標(biāo)記藍(lán)色標(biāo)記物以即用型混合物形式提供，使用前不需要加熱或添加變性劑。

表 1.顯示了與 DynaMarker® Small RNA II 相比的表觀分子量，以及適用于 DynaMarker DIG 標(biāo)記的小 RNA 藍(lán)色標(biāo)記物電泳的丙烯酰胺濃度。 （* 75 堿基 RNA 來自新合成的 RNA。75 堿基 RNA 不包含在 DynaMarker® Small RNA II 中。）

存儲(chǔ)緩沖區(qū) 

2 mM Tris-HCl (pH8.0)、8mM EDTA、78% 甲酰胺

質(zhì)量控制 

將 DynaMarker DIG 標(biāo)記的小 RNA 藍(lán)色標(biāo)記物在 37 °C 下孵育 24 小時(shí)后，在 15% 聚丙烯酰胺 - 7.5 M 尿素凝膠電泳中未觀察到標(biāo)記物明顯降解。 

建議上樣量 5 - 10 µl

電泳條件

確保在 10 - 15% 丙烯酰胺-尿素/1 × TBE 凝膠和 1 × TBE 作為運(yùn)行緩沖液上使用此標(biāo)記物。在其他條件下，條帶無法正確分離。

筆記

為了準(zhǔn)確地電泳測定分子量，
應(yīng)使用 DynaMarker® Small RNA II（代碼# DM192）或 DynaMarker® Small RNA II Easy Load（代碼# DM197）。

靈敏度

該標(biāo)記物適用于化學(xué)發(fā)光（例如CDP-star ®  * 1）免疫分析。靈敏度取決于高速即時(shí)膠片（例如FP-3000B* 2  ）、X光膠片或成像儀器的曝光時(shí)間長度。下圖顯示了一個(gè)示例。

圖 2. DynaMarker DIG 標(biāo)記的小 RNA 和 hsa-miR-21 藍(lán)色標(biāo)記的檢測。將 5 μl DynaMarker DIG 標(biāo)記的小 RNA 藍(lán)色標(biāo)記和 5 μg MCF-7 總 RNA 印跡到尼龍膜上，并將 hsa-miR-21 與 DIG 標(biāo)記的 DNA 探針 (2.5 nM) 雜交。使用抗 DIG-AP 抗體和 CDP-star® 檢測該標(biāo)記物和 has-miR-21。

*1：CDP-star® 是 Tropix, Inc. 的商標(biāo)。
*2：FP-3000B 是 Fujifilm Corp. 的產(chǎn)品。

推薦用法 

DynaMarker DIG 標(biāo)記的小 RNA 藍(lán)色標(biāo)記物適用于監(jiān)測變性丙烯酰胺凝膠電泳和膜上的印跡。一個(gè)例子如下所示：

• DynaMarker DIG 標(biāo)記的小 RNA 藍(lán)色標(biāo)記物的電泳和印跡

1) 15%聚丙烯酰胺-7.5M尿素凝膠的制備

40 % 丙烯酰胺：雙溶液 7.5 ml
尿素 9.0 g
10 × TBE 2.0 ml                                 
H2O 至 20 ml

尿素全溶解后，加入 20 μl TEMED 和 100 μl 10% 過硫酸銨。快速混合，然后將凝膠倒入立式凝膠裝置的模具中。

2)上樣和電泳。
使用前將 DynaMarker DIG 標(biāo)記的小 RNA 藍(lán)色標(biāo)記物全解凍。將變性的 RNA 樣品和 5 μl DynaMarker DIG 標(biāo)記的小 RNA 藍(lán)色標(biāo)記物裝入孔中，并使用 1 × TBE 電泳緩沖液在 200 V 下運(yùn)行凝膠。 3

)轉(zhuǎn)移 DynaMarker DIG 標(biāo)記的小 RNA 藍(lán)色標(biāo)記物和 RNA從凝膠到膜（圖 3）。

3-1)切一塊比凝膠稍大的帶正電的尼龍膜。將膜和四張適當(dāng)尺寸的吸墨紙浸泡在 1 × TBE 緩沖液中。
3-2)將兩張吸墨紙放在轉(zhuǎn)移池的陽極平臺(tái)上。
3-3)將膜放在吸墨紙上。
3-4)將凝膠從玻璃板轉(zhuǎn)移到膜的頂部并壓出任何氣泡。 （*確保膜和凝膠之間沒有氣泡。）
3-5)將另外兩張吸墨紙放在凝膠上，然后設(shè)置陰極組件。
3-6)以 2 mA/cm2 傳輸 30 - 60 分鐘。
3-7)確保標(biāo)記物成功轉(zhuǎn)移到膜上后，除去紙
和凝膠。用 2 × SSC 沖洗膜。
3-8)用UV交聯(lián)劑將RNA固定在膜上。
3-9)進(jìn)行Northern雜交(圖4)。

圖 3.
左： (1) 5 µl DynaMarker DIG 標(biāo)記的小 RNA 藍(lán)色標(biāo)記物、(2) 5 µg 人乳腺總 RNA 和 (3) 5 µg 乳腺腺癌 (MCF-7) 總 RNA 的電泳圖譜12.5 % 聚丙烯酰胺 - 7.5 M 尿素凝膠/1× TBE 緩沖液作為運(yùn)行緩沖液。
右： 將 (1) - (3) 印跡到尼龍膜上。

圖 4. hsa-miR-21 和 hsa-miR-16 的檢測 DIG 標(biāo)記的 DNA 探針與印有乳腺總 RNA 和 MCF-7 總 RNA 的尼龍膜雜交，并用抗 DIG-AP 抗體檢測探針和化學(xué)發(fā)光AP底物。

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